基因工程抗体(genetically engineering antibody)，也称为重抗体，是指利用基因重组技术，按不同需求对编码抗体的基因进行加工改造和重新装配，然后引入合适的受体细胞，从而表达生产出预期的抗体分子。基因工程抗体不仅可以对抗体的单区(H链V区)、最小识别单位(CDR3)、Fv、Fab 进行改造，还可以对完整的抗体分子进行改造，这使鼠单克隆抗体的异源性大大降低同时还可以根据需要将治疗或诊断用的药物及其他分子连接在抗体分子上，使单克隆抗体在科学研究和临床治疗领域具有重要的地位和广阔的应用前景。
基因工程抗体技术目标是减少鼠源成分，并且保留抗体的亲和力和特异性。应用基因工程技术，可对完整抗体及抗体片段进行改造。基因工程抗体具有多种优点:第一，使用基因工程技术改造，可使人体对抗体的排斥反应降低甚至消除；第二，基因工程抗体的分子量较小，更有利于穿透血管壁，最终进入病灶核心位置;第三，能够根据治疗需要，制备出新型抗体；第四，可采用原核、真核和植物细胞等表达方式，大量表达抗体分子，从而大大降低生产成本。
基因工程抗体的种类
基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体，主要包括两部分:一是对已有的单克隆抗体进行改造，包括单克隆抗体的人源化(嵌合抗体、CDR 移植抗体)、小分子抗体(单链抗体、scFv 多聚体、Fab 抗体、Fv 抗体、二硫键稳定抗体、纳米抗体等)及一些特殊抗体(双特异性抗体、细胞内抗体、抗体融合蛋白);二是通过抗体库的构建，使得抗体无须抗原免疫即可筛选并获得新的单克隆抗体。
1 人源化抗体
鼠源单克隆抗体作为异源性蛋白，在人体内可诱发人抗鼠抗体的生成(HAMA反应)，使得单抗在体内治疗应用明显滞后。为解决这一难题，人们设计了人源化抗体。在人源化抗体中，编码V区的基因序列来源于小鼠，而编码C区的基因来源于人。这种人源化的嵌合抗体用于人体所产生的HAMA反应比鼠源单抗明显减小;同时，人源的C区可更有效地介导人体内的一些免疫效应，如依赖于补体的细胞毒性作用(CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)等。本节介绍嵌合抗体和CDR移植抗体两种人源化抗体技术。
1.嵌合抗体
有研究者报道了抗半抗原磷酸胆碱的人鼠嵌合抗体的制备，并在哺乳动物细胞中得到成功表达。从杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别出功能性的VL，和VH分别与人的CL和CH相连后转入适的载体中，然后再共转染骨髓瘤细胞使其表达和生产嵌合抗体(图6-1)。目前已有超过20嵌合抗体进入临床试验阶段，如已经通过FDA批准用于临床治疗的抗CD3嵌合抗体、抗CD20嵌合抗体等。嵌合抗体主要有3种应用形式:嵌合IgG、嵌合Fab 和嵌合F(ab’)2。
(1)嵌合IgG 抗体
目前嵌合抗体的研究主要集中在嵌合IgG抗体方面，其构建的基本原理是从生产某种鼠源抗体的单克隆杂交瘤细胞中得到目的抗体V区基因，再与人的 C区基因按一定方式重组并克隆到合 适的表达载体中，然后转入受体细胞进行表达。 在构建嵌合抗体时应根据不同目的选择不同的C区片段，这是因为不同类型的人抗体 C 区与补体和 Fc 相互作用的能力及引发细胞溶解的功能不尽相同。 在体内免疫系统中，抗体的 Fc 段和效应细胞相互作用发挥特异的生物学功能。
(2)嵌合 Fab 和F(ab’)₂抗体
与大分子抗体相比，Fab和F(ab’)₂嵌合抗体的最大优点就是渗透性好。Fab 嵌合抗体的制备原理是:将功能性抗体 L、H链V区基因与人的κ链和 H链 CH 进行重组，克隆到表达载体中构建成嵌合基因表达载体，再转入宿主细胞进行表达。1994 年第一个Fab 嵌合抗体药物 ReoPro 被美国 FDA 批准上世。该药物上市以来治愈患者多达百万，是应用最成功的嵌合 Fab 抗体。为了改善治疗效果，人们把 Fab 抗体改造成嵌合F(ab’)₂,抗体，这不仅使抗体的分子量有了很大的提高，而且其药代动力学也有所改善，取得了一定的治疗效果。
常用的构建嵌合F(ab’)₂，抗体的方法有化学偶联法和重组末端修饰法。化学偶联法是利用化学偶联剂，如N-琥酰-3-(2-吡啶二硫基)丙盐酸、邻苯二马来酰亚胺和二硫代硝基苯甲酸等，经过一系列的氧化还原反应将抗体片段 Fab通过二硫键或醚键连接起来形成F(ab’)₂。重组末端修饰法也已经有成功的例子报道，研究者在CH的 C端连上一个(CPP);的基序，结果得到了比例高达70%的F(ab’)₂。也有人将一定长度的肽链连接于CH1的C端，或直接将Fd和轻链连接成Fab’，并通过调节链的长度制得了F(ab)2。由于嵌合 Fab抗体和合 F(ab’)₂抗体中没有Fc片段 不需要糖基化，因此不需要在哺乳动物细胞中表达。 大肠杆菌表达系统生产成本低，操作简单，产物表达量高而且易分离纯化因此很适合表达该种类型的抗体。
2.CDR 移植抗体
尽管合抗体Fc片段是人源化的，但V区的鼠源性保守序列在一定程度上仍能诱发HAMA，因此嵌合抗体不能彻底地消除鼠免疫原性，还需进一步对鼠源抗体的V区进行改造。抗体V区由CDR和骨架区组成。CDR 是抗体直接识别和结合抗原的区域决定了抗体的特异性，而骨架区序列及其立体结构较为保守，是嵌合抗体诱发 HAMA 的主要原因，因此将鼠单克隆抗体 CDR移植到人单克隆抗体的V区框架上。图 6-2 为CDR移植抗体设计流程图。这种将鼠单抗的CDR区移植到人单抗的骨架区组成的抗体 就称为CDR移植抗体，也称为改型抗体。
2 小分子抗体
小分子抗体因其分子小、穿透性强、抗原性低、可在原核系统中表达、易于对其基因进行操作等优点而受到研究者的重视并成为基因工程抗体的研究热点。常见的单价小分子抗体有 scFv、Fab、Fv、二硫键稳定的 Fv、单域抗体、超变区等。多价小分子抗体有双链抗体(diabody)、三链抗体 (triabody)和微型抗体(minibody)等。
1.单链抗体
用适当的寡核苷酸接头将 L 链和 H 链的 V区连接起来，使之形成单一的多肽链，称为单链抗体(single chain Fv, scFv)。多肤链能自发折叠成天然构象，保持 Fv 的特异性和亲和力。scFv 中连接DNA(linker DNA)的设计原则是DNA接头编码的氨基酸不干扰VH和VL的立体构象，并不妨碍抗原结合部位。氨基酸组成应具有较少的侧链，便于折叠和减少抗原性。一般由甘氨酸和丝氨酸组成(Gly4Ser)n，它的长度通常是14或15个氨基酸残基。scFv的优点是分子量小、免疫原性弱、渗透力强，并可用于药物导向、中和毒素等。缺点是无抗体C区，不能介导抗体的其他生物学效应。
VH和VL的拼接方法有两种，一种是将linker设计在表达载体上，两端各有限制性内切酶酶切位点供VH和VL的插入。另一种是重叠延伸拼接法(splicing by overlap extension,SOE)，是把linker 的编码序列分别设计在扩增VH和VL的引物中，用PCR直接合成scFv基因。VH和VL通过linker互补序列，互为引物及模板合成完整的scFv基因,再以两端的引物进行PCR扩增得到scFv基因产物。图6-3 为通过SOE法构建scFv的示意图。
2.scFv多聚体
在scFv 的基础上发展了结合性能良好的scFv 多聚体diabodies、tribodies及tetribodies 等，这些多聚体之间的转换依赖linker长度的变化。scFv的linker 长度一般为15个氨基酸，如linker 的长度缩短为3~12个氨基酸，同一scFv分的VH与VL区就不能正常相互配对，来自不同分子的VH与VL功能区配对 形成一个二聚体，即 diabodies。当 linker 被进一步缩短为 0~2个氨基酸时，VH的C端残基就直接与另一个VL的N端残基相连两个scFv分子先构成一个diabodies，然后两端游离的VH、VL就可与第三个scFv分子构成一个三价的三聚体，即tribodies。有研究表明，如果不使用linker,则表达产物折叠后更易形成 tribodies，而不是diabodies。
3.Fab 抗体
Fab片段是由H链F 段和完整L链通过二硫键形成的异二聚体，仅含一个抗原结合位点，大小为完整抗体的1/3。用木瓜水解酶消化完整抗体可获得2个 Fab片段。在 Fab 基因表达时，5’端带上细菌蛋白信号肽基因的Fd基因和L链基因，可在大肠杆菌细胞壁的周质腔内分泌型表达，形成完整的立体折叠。Fab片段保持了亲本抗体的抗原结合特异性和生物学活性。Fd基因片段和L链基因可以分别构建在两个载体上，然后共转染细胞，也可以构建在一个载体上转染细胞进行表达(图 6-4)。Fab 片段有中和毒素和病毒、封闭受体和药物的 螯合作用，Fab片段的免疫原性低，但半衰期也比完整抗体短得多。
4.Fv抗体
Fv是由H链和L链V区组成的单价小分子，分子量只有完整分子的1/6，是与抗原结合的最小功能片段。Fv抗体分子小、免疫原性弱、对实体瘤的穿透力强。可作为载体与药物、毒素等相结合，用于肿瘤的诊断和治疗。在 Fv的基因工程技术中，可以 分别构建含VH和VL基因的载体，共转 染细胞，使之各自表达后组装成功能性 Fv分子;或者载体中的VH和VL之间设置终止码分别表达2个小分子片段。 H链和L链的V区可以非共价键结合在一起形成 Fv，并能保持特异结合抗原的能力。
5.二硫键稳定抗体
二硫键稳定抗体(disulfied- stablized Fy，dsFy)是在 scFv 的基础上发展起来的一类新型基因工程抗体，它是将抗体VH和VL的 各1个氨基酸残基突变为半胱氨酸，通过链间二硫键连接VH和VL可变区的抗体。 通用的突变位点是重链的44位和轻链的100位或重链的105位和轻链的43位。 dsFv 的优点是生化性质稳定能够耐受环境条件的剧烈作用。 自 1990 年报道构建 dsFv 以来dsFv 及 dsFv-免疫毒素的研究得到了突飞猛进的发展
6.纳米抗体
只由一个H链V区组成的单域抗体被称为VHH抗体(variabledomain ofheavy chain ofheavy-chain antibody,VHH)，晶体结构直径2.5nm、长 4nm，因此被称为纳米抗体。纳米抗体中没有L链的存在，CDRs 区也只有3 个，比普通抗体少了一半。与普通抗体相比，纳米抗体具有更为广泛的抗原结合能力，从小分子的半抗原和肤，到大分子的蛋白质和病毒都能被纳米抗体识别和结合，甚至当靶蛋白的识别位点被紧密包裹在分子内部时，纳米抗体也可对其表位识别。
3 特殊基因工程抗体
在普通抗体的基础上可以通过基因工程等手段生产出一些自然界不存在的、有特殊功能的抗体，如双特异性抗体、细胞内抗体、抗体融合蛋白、分泌型抗体等。它们在肿瘤治疗、基础研究等领域发挥着重要作用。
1.双特异性抗体
双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是一类具有双功能的杂交分子。二价抗体中的Fab段具有不同特异性，能与不同的配体结合。BsAb 具有双特异性，具有许多特有的生物学特性。它 可以同时与两种不同的抗原结合并使之交联，因而可介导标记与靶抗原结合，或使某种效应因子定位于靶细胞，在介导肿瘤胞的杀伤中有着广阔的应用前景。
2.细胞内抗体
表达于细胞内和直接定位于亚细胞器的抗体分子被称为细内抗体，简称为内抗体(intrabodies)。细胞内抗体是应用基因重技术在胞内对抗体基因进行修饰，如加核定位信号或胞浆定位信号，这样经表达有活性的抗体就会定位在细胞核、胞浆或某些细胞器，干扰或阻断靶抗原的活性及加工、分泌过程等。细胞内抗体有抑制细胞膜受体表达、灭活原癌基因蛋白产物、阻碍病毒复制等作用。
3.抗体融合蛋白
由于小分子抗体易进行分子改造，故常用来与其他蛋白质融合而得到具有多种功能的融合蛋白。目前研制的抗体融合蛋白主要是将Fv段与其他生物活性蛋白质结合，利用抗体的特异性识别功能将生物活性物质引导到特定部位，进而发挥生物学功能。最常见的抗体融合蛋白有免疫毒素、免疫细胞因子和分泌型抗体等.
